Wojciech Rogóż, Aleksandra Owczarzy, Karolina Kulig, Małgorzata Maciążek-Jurczyk

Opracowanie eksperymentalnych modeli antyoksydantów surowicy krwi ludzkiej (EHSAMs) oraz optymalizacja testów DPPH i ABTS do badania ich aktywności antyoksydacyjnej

DOI: 10.32383/farmpol/235952

2026-10-02

Przedmiot badań. Czynniki zewnętrzne (egzogenne) mogą wpływać na aktywność antyoksydacyjną endogennych przeciwutleniaczy. Z tego względu, do dokładnej oceny ich oddziaływania potrzebne są odpowiednio zaprojektowane modele badawcze. Powinny one uwzględniać więcej składników niż roztwory pojedynczych antyoksydantów, a równocześnie być dostępniejsze niż próbki biologiczne, jak np. surowica. Pozwoli to na bardziej realistyczne odzwierciedlenie in vitro warunków panujących in vivo. Przykładem tego typu syntetycznych układów wieloskładnikowych są eksperymentalne modele antyoksydantów surowicy krwi ludzkiej (ang.: experimental human serum antioxidant models, EHSAMs).

Cel badań. Celem badań było dostosowanie protokołów wybranych testów kolorymetrycznych do oceny aktywności antyoksydacyjnej modeli EHSAMs oraz zweryfikowanie poprawności uzyskanych wyników.

Materiały i metody. Aby zrealizować powyższy cel badań, przeprowadzono pomiary spektrofotometryczne z użyciem testów DPPH i ABTS. Przeanalizowano aktywność antyoksydacyjną próbek albuminy surowicy ludzkiej (ang.: human serum albumin, HSA), oraz ludzkiej surowicy normalnej (ang.: normal human serum, S1) o różnych rozcieńczeniach. W drugim etapie badań analizowano otrzymany laboratoryjnie model ludzkiej surowicy normalnej (ang. normal, N), oznaczony numerem 7 (EHSAM N7).

Wyniki. Aktywność antyoksydacyjna HSA była niższa niż S1 zarówno w teście DPPH, jak i ABTS, bez względu na czas inkubacji. Określono, że optymalne rozcieńczenie dla testów DPPH i ABTS to odpowiednio rozcieńczenie 15-krotne oraz 200-krotne. Z kolei za najbardziej odpowiedni czas inkubacji uznano 30 minut dla testu DPPH oraz 90 minut dla testu ABTS. Ponadto stwierdzono, że test DPPH powinien być stosowany wyłącznie jako narzędzie uzupełniające wobec testu ABTS. Zastosowanie tych założeń pozwoliło ocenić aktywność antyoksydacyjną EHSAM N7 i porównać ją z wynikami uzyskanymi dla HSA i S1. Na tej podstawie oceniono, że aktywność antyoksydacyjna badanych próbek może zostać opisana poprzez zależność: HSA=EHSAM N7

Wnioski. Spektroskopowe testy kolorymetryczne, zwłaszcza test ABTS, pozwalają na wiarygodne zbadanie aktywności antyoksydacyjnej HSA, surowicy ludzkiej normalnej oraz modeli EHSAMs. Potwierdzono wyjściową hipotezę, że aktywność antyoksydacyjna HSA i EHSAM N7 nie różni się znacząco od siebie. Koncepcja wykorzystania modeli EHSAMs w badaniach z zakresu nauk farmaceutycznych jest uzasadniona, a jej wdrożenie może przynieść wiele korzyści naukowcom, pacjentom oraz przedstawicielom przemysłu.

Słowa kluczowe: EHSAMs, antyoksydanty, DPPH, ABTS, surowica, albumina.

© Farm Pol, 2026, 82(4): 171–182

Designing experimental human serum antioxidant models (EHSAMs) and optimizing DPPH and ABTS assays to evaluate their antioxidant activity

Research’s study. External (exogenous) factors may influence the antioxidant activity of endogenous antioxidants. Therefore, appropriately designed research models are needed to evaluate their impact accurately. They should include more components than single-antioxidant solutions, and they should also be more available for scientific research than biological samples, such as serum. This could create a more realistic representation of in vivo conditions in in vitro analysis. Experimental human serum antioxidant models (EHSAMs) are an example of this type of multi-component system.

Purpose. The aim of the study was to adapt the protocols for selected colorimetric assays to study the antioxidant activity of EHSAMs models and to confirm the validity of the obtained results.

Materials and methods. In order to achieve these goals, spectrophotometric measurements were performed using the DPPH and ABTS assays. The antioxidant activity of human serum albumin (HSA) and normal human serum (S1) samples at various dilutions was analyzed. In the second step of the study, a laboratory-prepared model of normal human serum, labeled as sample 7 (EHSAM N7), was checked.

Results. The antioxidant activity of HSA was lower than that of S1 in both DPPH and ABTS assays, regardless of the incubation time. It was determined that the optimal dilutions for the DPPH and ABTS assays were 15-fold and 200-fold, respectively. The optimal incubation times were 30 and 90 minutes for the DPPH and ABTS assays, respectively. Furthermore, it was concluded that the DPPH assay should be used only as a supplementary tool for the ABTS assay. These results made it possible to evaluate the antioxidant activity of EHSAM N7 and to compare it with that of HSA and S1. Based on this, it was concluded that the antioxidant activity of the tested samples could be described by the following order: HSA=EHSAM N7

Conclusions. Spectrophotometric colorimetric assays, especially the ABTS assay, can be used to reliably evaluate the antioxidant activity of HSA, normal human serum, and EHSAMs models. The initial hypothesis that there is no significant difference in the antioxidant activity of HSA and EHSAM N7 was confirmed. The concept of using EHSAMs models in pharmaceutical research is justified, and its implementation could be beneficial for scientists, patients, and industry representatives.

Keywords: EHSAMs, antioxidants, DPPH, ABTS, serum, albumin.

© Farm Pol, 2026, 82(4): 171–182