Mateusz Broncel, Emilia Morawiec, Ewa Nowak, Agnieszka Polak, Daria Matczyńska, Adam Pudełko, Anna Bednarska-Czerwińska

Wytwarzanie podwójnie celowanych komórek CAR-T (anty-BCMA/anty-GPRC5D) w zamkniętym systemie kompatybilnym z wymaganiami GMP – charakterystyka produktu i aktywność in vitro na modelu szpiczaka mnogiego

2026-09-09

Przedmiot badań. Limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (komórki CAR-T, ang. Chimeric antigen receptor T cell) stanowią produkty lecznicze terapii zaawansowanej (ang. Advanced Therapy Medicinal Products, ATMP), których jakość jest bezpośrednio zależna od przebiegu procesu wytwarzania. W przypadku produktów autologicznych krytyczne znaczenie mają parametry procesu (ang. Critical Process Parameters, CPP) wpływające na uzyskanie wymaganej jakości produktu (ang. Critical Quality Attributes, CQA), takie jak skuteczność transferu genów, skład populacji komórkowej oraz aktywność biologiczna. Jednoczesne ukierunkowanie limfocytów T przeciwko antygenom BCMA (ang. B-cell maturation antigen) i GPRC5D (ang. G protein-coupled receptor class C group 5 member D) może zwiększać skuteczność terapii szpiczaka mnogiego poprzez ograniczenie zjawiska ucieczki antygenowej, jednak wymaga opracowania powtarzalnego procesu umożliwiającego efektywną kotransdukcję dwoma wektorami lentiwirusowymi.

Cel badań. Celem pracy była ocena wykonalności zamkniętego, zautomatyzowanego procesu wytwarzania podwójnie ukierunkowanego produktu CAR-T anty-BCMA/anty-GPRC5D na platformie kompatybilnej z wymaganiami GMP, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu procesu na kluczowe parametry jakości otrzymanego produktu.

Materiał i metody. Proces obejmujący aktywację limfocytów T, jednoczesną kotransdukcję dwoma wektorami lentiwirusowymi oraz 14-dniową ekspansję komórek prowadzono na platformie CliniMACS Prodigy w systemie zamkniętym. Obecność obu transgenów potwierdzono metodami molekularnymi. Ocenie poddano wydajność transferu genów na podstawie ekspresji GFP, zmiany immunofenotypu komórek, aktywność cytotoksyczną wobec linii szpiczaka mnogiego NCI-H929 przy różnych stosunkach efektor:cel (E:T), wynoszących 1:1, 1:2 i 1:5, oraz profil wydzielanych cytokin jako wskaźnik funkcjonalności produktu.

Wyniki. Proces umożliwił uzyskanie produktu CAR-T spełniającego założone kryteria funkcjonalne. Odsetek komórek GFP-dodatnich osiągnął 30,7% w 14. dniu hodowli, a udział limfocytów CD8⁺ zwiększył się z 22,4% do 50,8%, wskazując na skuteczną ekspansję populacji efektorowej. Po 48 godzinach kokultury z komórkami NCI-H929 zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych wyniosło odpowiednio 94,12%, 76,14% oraz 46,39% dla stosunków E:T 1:1, 1:2 i 1:5. Analiza wydzielanych cytokin wykazała dominację odpowiedzi typu Th1, potwierdzając zachowanie aktywności efektorowej komórek po zakończeniu procesu wytwarzania.

Wnioski. Uzyskane wyniki stanowią wstępny dowód wykonalności wytwarzania podwójnie ukierunkowanego produktu CAR-T w zamkniętym, zautomatyzowanym środowisku kompatybilnym z wymaganiami GMP, przy zachowaniu ocenianych parametrów jakości i aktywności biologicznej produktu. Jednocześnie niższa wydajność transferu genów względem warunków laboratoryjnych wskazuje, że transfer procesu do warunków GMP wymaga dalszej optymalizacji oraz formalnej walidacji krytycznych parametrów procesu zgodnie z założeniami podejścia Quality by Design. Przedstawione dane mają charakter proof-of-concept i nie stanowią pełnej walidacji procesu wytwarzania.

Słowa kluczowe: szpiczak plazmocytowy; limfocyty CAR-T; BCMA; GPRC5D; produkty lecznicze terapii zaawansowanej.

© Farm Pol, 2026, 82(3): 159–167

Manufacturing of dual anti-BCMA/anti-GPRC5D CAR-T cells in a closed, GMP-compatible system – product characterization and in vitro activity in a multiple myeloma model

Background. Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells are classified as Advanced Therapy Medicinal Products (ATMPs), whose quality is intrinsically dependent on the manufacturing process. For autologous cell-based medicinal products, Critical Process Parameters (CPPs) directly influence Critical Quality Attributes (CQAs), including gene transfer efficiency, cellular composition, and biological activity. Simultaneous targeting of the BCMA and GPRC5D antigens may improve the therapeutic efficacy against multiple myeloma by reducing the risk of antigen escape; however, this approach requires a robust and reproducible manufacturing process enabling efficient co-transduction with two lentiviral vectors.

Objective. The aim of this study was to evaluate the feasibility of a closed, automated manufacturing process for dual-targeted anti-BCMA/anti-GPRC5D CAR-T cells using a platform compatible with GMP requirements, with particular emphasis on the impact of the manufacturing process on selected critical quality attributes of the final product.

Materials and Methods. The manufacturing process was performed using the CliniMACS Prodigy platform and included T-cell activation, simultaneous co-transduction with two lentiviral vectors, and a 14-day expansion in a closed system. The presence of both transgenes was confirmed using molecular methods. Gene transfer efficiency was assessed by GFP expression, while immunophenotypic changes, cytotoxic activity against the NCI-H929 multiple myeloma cell line at different effector-to-target (E:T) ratios, and cytokine secretion profiles were evaluated as indicators of product functionality.

Results. The manufacturing process enabled the generation of a dual-targeted CAR-T cell product fulfilling the predefined functional quality criteria. The proportion of GFP-positive cells reached 30.7% on day 14 of culture, while the percentage of CD8⁺ T cells increased from 22.4% to 50.8%, indicating effective expansion of the cytotoxic T-cell population. Following 48 hours of co-culture with NCI-H929 cells, tumor growth inhibition reached 94.12%, 76.14%, and 46.39% at E:T ratios of 1:1, 1:2, and 1:5, respectively. Cytokine analysis demonstrated a predominantly Th1-oriented immune response, confirming the preservation of effector function throughout the manufacturing process.

Conclusions. The presented results provide preliminary proof of feasibility for manufacturing a dual-targeted CAR-T product in a closed, automated environment compatible with GMP requirements while preserving the evaluated quality attributes and biological activity. Nevertheless, the lower gene-transfer efficiency observed compared with laboratory-scale production indicates that transfer of the process to GMP conditions requires further optimization and formal validation of critical process parameters within a Quality by Design (QbD) framework. These proof-of-concept data should therefore not be interpreted as full process validation.

Keywords: multiple myeloma, CAR-T cells, BCMA, GPRC5D, advanced therapy medicinal products.

© Farm Pol, 2026, 82(3): 159–167